Abstracto

En Química Orgánica 2018: Herramientas químicas para investigar la ubiquitinación de proteínas - Jun Yin

 Jun Yin Profesor asociado Universidad Estatal de Georgia, EE.UU.

 La ubiquitina (UB) se transfiere a través de una cascada enzimática E1-E2-E3 a las proteínas sustrato para regular su estabilidad y funciones biológicas en la célula. El genoma humano codifica 2 E1, 45 E2 y más de 600 E3. Juntos forman una red compleja de transferencia de UB para la modificación de proteínas celulares. Actualmente, quedan por resolver preguntas clave sobre cómo identificar los objetivos de ubiquitinación de E3 importantes para mapearlos en las redes de señalización celular, y cómo se ensamblan las cadenas de UB de enlaces específicos para codificar señales únicas en la célula. Hemos desarrollado un método al que nos referimos como "transferencia de UB ortogonal" (OUT) para desentrañar la complejidad de las redes de ubiquitinación de proteínas. La clave de OUT es diseñar una cascada de enzimas E1, E2 y E3 diseñadas (xE1, xE2 y xE3) que transfieren exclusivamente un UB diseñado (xUB) a los sustratos de un xE3. Expresamos xUB y la cascada OUT en la célula, purificamos las proteínas conjugadas con xUB y revelamos sus identidades mediante proteómica. Las proteínas del análisis OUT son los sustratos potenciales del E3 en la cascada OUT. Hemos desarrollado cascadas OUT con HECT E3 E6AP y U-box E3s E4B y CHIP e identificado nuevos circuitos celulares regulados por estos E3. Para investigar el mecanismo de la síntesis de la cadena UB catalizada por E2, hemos generado conjugados di-UB específicos de enlace mediante la incorporación de aminoácidos no naturales y la ligación de proteínas expresadas. Los conjugados di-UB imitan los modos de unión de los UB donantes y aceptores en el sitio activo de E2 para la síntesis de la cadena UB. Al caracterizar la estructura de los conjugados E2-diUB, revelamos cómo E2 regula la síntesis de cadenas UB de diferentes enlaces. La ubiquitina (Ub) es una proteína reguladora pequeña (8,6 kDa) de 76 aminoácidos que adopta un pliegue de agarre β. La Ub está muy conservada en los organismos eucariotas. La conjugación de la ubiquitina con una proteína diana se denomina ubiquitinación o ubiquitilación.1 Normalmente, la Ub se una a las proteínas a través de un enlace isopeptídico entre el carboxilato C-terminal de la ubiquitina (glicina 76) y un grupo ε-amino de un residuo de lisina dentro de las proteínas aceptoras. La ubiquitinación es una modificación postraduccional (PTM) crucial y reversible en las células eucariotas. Desde su descubrimiento a finales de los años 1970 y principios de los años 1980, la modificación por la ubiquitina ha surgido como un mecanismo regulador importante en la mayoría de los procesos celulares en eucariotas. La ubiquitinación afecta a las proteínas del sustrato de muchas maneras diferentes, incluyendo la señalización, la degradación proteasómica, las alteraciones de la localización celular, la modulación de la actividad catalítica y la promoción o prevención de las interacciones proteicas.2, 3 Los procesos celulares regulados por la ubiquitinación incluyen el ciclo celular,la transcripción, el tráfico, la inflamación y la reparación del ADN. Cabe destacar que muchos de los procesos son independientes de la degradación de proteínas mediada por el proteasoma. La ubiquitinación implica tres pasos enzimáticos principales catalizados por las enzimas activadoras de la ubiquitina (E1), las enzimas conjugadoras de la ubiquitina (E2), y ubiquitina ligasas (E3) (ver Fig. 1).5 Primero, la ubiquitina se activa durante una reacción de dos pasos por una E1 (enzima activadora de ubiquitina) con el consumo de ATP, formando un intermediario adenilato de ubiquitina y posteriormente un enlace tioéster entre el carboxilo C-terminal de la ubiquitina y por lo tanto el sitio cisteína de E1. El genoma humano contiene dos E1, es decir UBA1 y UBA6.8 E2 cataliza la transferencia de Ub desde el conjugado Ub-E1 al sitio cisteína de E2 y forma el conjugado Ub-E2 a través de una reacción de transtioesterificación. El genoma humano posee bastantes 30 enzimas E2 diferentes. La ubiquitina ligasa E3 cataliza el paso final de la cascada de ubiquitinación transfiriendo Ub desde el conjugado Ub-E2 a la proteína sustrato. Las E3 tienen especificidad de sustrato para las enzimas E2. Las ligasas cullin-RING, que constituyen el grupo más importante de E3 (alrededor de 600 miembros), no forman un enlace químico con Ub. Dos grupos más pequeños de E3, las ligasas HECT (alrededor de 30 miembros) y las ligasas RBR (alrededor de 12 miembros), forman un intermediario tioéster de Ub con la cisteína del sitio E3.forman un intermediario tioéster de Ub con la cisteína del sitio E3.forman un intermediario tioéster de Ub con la cisteína del sitio E3.