Jun-ichi Kadokawa
En este artículo se informa sobre un estudio de la fosforolisis enzimática de sustratos de oligo-d-glucosaminida unidos a α(1→4) mediante catálisis por α-glucano fosforilasa termoestable (de Aquifex aeolicus VF5). La α-glucano fosforilasa cataliza tanto la fosforolisis como la glucosilación/polimerización en el extremo no reductor de los sustratos de glucosa unidos a α(1→4) dependiendo de las condiciones. Los autores también descubrieron que el polímero de d-glucosaminida unido a α(1→4) (estereoisómero de quitosano) se obtenía mediante la polimerización enzimática catalizada por α-glucano fosforilasa termoestable de α-d-glucosamina 1-fosfato a partir de un precursor de maltooligosacárido. En la presente investigación, esperamos descubrir si el compuesto cataliza la fosforolisis de sustratos que contienen dichas cadenas de d-glucosaminida. Los sustratos de oligo-d-glucosaminida α(1→4)-conectados que se extienden desde la maltotriosa se prepararon primero mediante la polimerización enzimática catalizada por la α-glucano fosforilasa termoestable de la α-d-glucosamina 1-fosfato a partir de la maltotriosa preliminar y la limpieza resultante mediante HPLC preparativa. La fosforolisis de los sustratos posteriores se dirige a la vista de la α-glucano fosforilasa termoestable en el colchón de fosfato. Los resultados expositivos de los artículos apoyaron completamente el evento de fosforolisis en el extremo no reductor de ambas cadenas de sucesiones de d-glucosamina-α(1→4)-d-glucosamina y d-glucosamina-α(1→4)-d-glucosa. La polimerización enzimática se ha destacado como una excelente manera de abordar la polimerización integrada compuesta por enlaces glucosídicos controlados por sistema sólido y regio [1-6]. La α-glucano fosforilasa es una de las sustancias químicas que se han utilizado prácticamente como impulsor de la polimerización enzimática para crear polisacáridos bien caracterizados. La α-glucano fosforilasa cataliza la fosforolisis in vivo de α(1→4)-glucanos, como la amilosa y el glucógeno en el extremo no reductor en presencia de fosfato inorgánico (Pi) para producir α-D-glucosa 1-fosfato (Glc-1-P). Debido a la reversibilidad de dicha reacción fosforólitica, este catalizador también cataliza la glucosilación in vitro de α(1→4)-glucano como aceptor de glicosilo, como el maltooligosacárido, utilizando Glc-1-P como donante de glicosilo para crear un enlace α(1→4)-glucosídico con Pi liberador. La respuesta reversible por catálisis de la α-glucano fosforilasa se resume de la siguiente manera: [α (1→4)- Glc]n+1+Pi → [α (1→4)- Glc]n+Glc-1-P. En las condiciones en las proporciones enormes de dador/aceptor, las glucosilaciones progresivas en el extremo no reductor alargador del maltooligosacárido como base ocurren por catálisis de la α-glucano fosforilasa, lo que provoca la polimerización enzimática para producir un polisacárido unido a (1→4), es decir, amilosa. El nivel de polimerización (DP) de la amilosa puede verse limitado por la proporción de alimentación de dador/aceptor. Las α-glucano fosforilasas han demostrado la particularidad diversa para el reconocimiento de sustratos, dependiendo de sus fuentes.Por ejemplo, los sustratos más pequeños percibidos por la α-glucano fosforilasa más ampliamente reconocida desprendida de fuentes bacterianas termófilas (α-glucano fosforilasa de patata) en las respuestas de fosforólisis y glucosilación son normalmente maltopentaosa (Glc5) y maltotetraosa (Glc4), respectivamente. Por otro lado, Glc4 y maltotriosa (Glc3) son los sustratos más pequeños percibidos por la α-glucano fosforilasa segregada de fuentes bacterianas termófilas (α-glucano fosforilasa termoestable) en las respuestas de fosforólisis y glucosilación, respectivamente. Además, se sabe que las α-glucano fosforilasas muestran una débil explicitud para la aceptación de sustratos, lo que también se ha visto como dependiente de sus fuentes. La α-glucano fosforilasa de la patata cataliza las glucosaminilaciones enzimáticas utilizando α-D-glucosamina 1-fosfato (GlcN-1-P) y su subordinado, N-formil-α-D-glucosamina 1-fosfato (GlcNF-1-P), como benefactores de glicosilo no locales en la base de derivación de ácido acético para producir oligosacáridos que tienen una unidad GlcN(F) en el extremo no reductor, mientras que las glucosaminilaciones progresivas que utilizan GlcN-1-P ocurren por catálisis de α-glucano fosforilasa termoestable (de Aquifex aeolicus VF5) en el soporte de derivación de ácido acético, dando lugar a cadenas de oligo-GlcN unidas a α(1→4) en el extremo no reductor de los aceptores de glicosilo, por ejemplo, Glc3, el aceptor de glicosilo más pequeño para este catalizador. Sin embargo, al aumentar la proporción de alimento benefactor/aceptor, las estimaciones de DP de las cadenas α(1→4)-GlcN se mantuvieron en un nivel de cinco. Este resultado demostró que la prolongación adicional de la cadena se vio obstaculizada por el Pi producido a partir de GlcN-1-P, ya que es un sustrato local para la fosforolisis por catálisis de la α-glucano fosforilasa. Luego se intentó eliminar el Pi como un acelerador del campo de glucosaminilación enzimática al realizar la reacción en un soporte de amonio (0,5 M, pH 8,5) que contenía MgCl2, a la luz del hecho de que el estudio anterior ha demostrado que el Pi forma una sal insoluble con partículas de amonio y magnesio. Por lo tanto, las glucosaminilaciones enzimáticas progresivas se aceleraron en el marco de la cuna para producir la polimerización de GlcN-1-P a partir de la base Glc3, dando lugar al polímero de D-glucosaminida α(1→4)-conectado, que se asemeja a la estructura de un estereoisómero de quitosano]. Con base en los resultados anteriores, hemos supuesto que la α-glucano fosforilasa termoestable cataliza la glucosaminilación utilizando GlcN-1-P, pero también la fosforolisis en el extremo no reductor de la cadena de glucosaminida α(1→4)-conectada, dependiendo de la centralización de Pi. Además, se explicó que la α-glucano fosforilasa termoestable (de Escherichia coli) mostró las distintas prácticas sinérgicas hacia la fosforolisis y la glucosilación dependiendo de las condiciones de reacción. En el presente artículo,Informamos sobre el examen exacto para descubrir si la α-glucano fosforilasa termoestable cataliza la fosforólisis de sustratos de oligo-D-glucosaminidas-maltotriosa (GlcNm-Glc3) conectados a α(1→4). Originalmente organizamos los sustratos de oligo-D-glucosaminidesmaltotriosa α(1→4)-conectados para la fosforolisis, es decir, tetrahexasacáridos (GlcN-Glc3, GlcN2-Glc3 y GlcN3-Glc3) mediante la polimerización enzimática catalizada por fosforilasa termoestable de GlcN-1-P como se indica por el procedimiento de escritura. El sustrato más pequeño, Glc3, se utilizó como introducción para la polimerización para evitar el evento de fosforolisis de la base, debido a que el compuesto no cataliza su fosforolisis. La reacción se llevó a cabo en una proporción de alimentación de GlcN-1-P/Glc3 de 10:1 en presencia de una α-glucano fosforilasa termoestable en una cuna alcalina (pH 8,5) que contenía partículas de Mg2+ a 40 °C durante 48 h. En esta investigación se utilizó el tiempo de reacción más corto que la condición de escritura (7 días) para producir GlcNm-Glc3 con valores bajos de DP. La espectrometría de masas MALDI-TOF del producto bruto después del tratamiento con GA observa algunos picos relacionados con las masas subatómicas de oligosacáridos que contienen de una a cinco unidades de GlcN, lo que respalda la producción de GlcNm-Glc3 más corto que los productos de escritura (m = ~ 12). Además, el resultado de MALDI-TOF MS no demuestra ningún evento de hidrólisis de tipo exo en la sección Glc3 en los oligosacáridos producidos por catálisis de GA, lo que sugiere la proximidad de las cadenas de GlcN en el extremo no reductor de Glc3. El cromatograma de HPLC después del balance del producto con ácido clorhídrico muestra los pináculos plurales relacionados con oligosacáridos con diferentes DP. Según sea necesario, las partes de un pináculo A relacionado con un tetrasacárido y los pináculos B y C relacionados con penta y hexasacáridos se recopilaron mediante HPLC preparativa. El MALDI-TOF MS de las partes anterior y final muestra los pináculos relacionados con las masas atómicas de GlcN-Glc3 y GlcN2-Glc3/GlcN3-Glc3, respectivamente, lo que demuestra que el tetrasacárido y una mezcla de penta y hexasacáridos se separaron de manera efectiva.El MALDI-TOF MS del producto bruto después del tratamiento con GA observa algunos pináculos relacionados con las masas subatómicas de oligosacáridos que contienen de una a cinco unidades de GlcN, lo que respalda la creación de GlcNm-Glc3 más corto que los productos de escritura (m = ~ 12). Además, el resultado de MALDI-TOF MS tampoco demuestra ningún evento de hidrólisis de tipo exo en la sección Glc3 en los oligosacáridos producidos por catálisis de GA, lo que sugiere la proximidad de las cadenas de GlcN en el extremo no reductor de Glc3. El cromatograma de HPLC después del equilibrio del producto con ácido clorhídrico muestra los pináculos plurales relacionados con oligosacáridos con diferentes DP. Según sea necesario, las partes de un pináculo A relacionado con un tetrasacárido y los pináculos B y C relacionados con penta y hexasacáridos se recopilaron mediante HPLC preparativa. El MALDI-TOF MS de las partes anterior y última muestra máximos relacionados con las masas atómicas de GlcN-Glc3 y GlcN2-Glc3/GlcN3-Glc3, individualmente, lo que demuestra que el tetrasacárido y una mezcla de penta y hexasacáridos se separaron efectivamente.El MALDI-TOF MS del producto bruto después del tratamiento con GA observa algunos pináculos relacionados con las masas subatómicas de oligosacáridos que contienen de una a cinco unidades de GlcN, lo que respalda la creación de GlcNm-Glc3 más corto que los productos de escritura (m = ~ 12). Además, el resultado de MALDI-TOF MS tampoco demuestra ningún evento de hidrólisis de tipo exo en la sección Glc3 en los oligosacáridos producidos por catálisis de GA, lo que sugiere la proximidad de las cadenas de GlcN en el extremo no reductor de Glc3. El cromatograma de HPLC después del equilibrio del producto con ácido clorhídrico muestra los pináculos plurales relacionados con oligosacáridos con diferentes DP. Según sea necesario, las partes de un pináculo A relacionado con un tetrasacárido y los pináculos B y C relacionados con penta y hexasacáridos se recopilaron mediante HPLC preparativa. El MALDI-TOF MS de las partes anterior y última muestra máximos relacionados con las masas atómicas de GlcN-Glc3 y GlcN2-Glc3/GlcN3-Glc3, individualmente, lo que demuestra que el tetrasacárido y una mezcla de penta y hexasacáridos se separaron efectivamente.
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