Abstracto

Congreso Europeo de Biotecnología 2015: Mejora de la producción de flavonoides mediante el ajuste sistemático de las vías metabólicas centrales basadas en un sistema de interferencia CRISPR en Escherichia coli - Jingwen Zhou - Universidad de Jiangnan

Jingwen Zhou 1,2 , Jianghua Li 1,2 , Junjun Wu 1,2 , Guocheng Du 1,2 y Jian Chen 1,2

El suministro limitado de malonil-CoA intracelular en Escherichia coli impide la síntesis biológica de policétidos, flavonoides y biocombustibles. En este trabajo, se construyó un sistema de interferencia de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas (CRISPR) para ajustar las vías metabólicas centrales y canalizar de manera eficiente el flujo de carbono hacia el malonil-CoA. Utilizando sgRNA sintético para silenciar genes candidatos, se utilizaron como genes diana los genes que podían aumentar el nivel intracelular de malonil-CoA en más del 223%. Se ajustaron las eficiencias de represión de estos genes diana para alcanzar niveles apropiados de manera que el nivel intracelular de malonil-CoA se mejorara sin alterar significativamente la acumulación de biomasa final (la OD600 final disminuyó menos del 10%). Según los resultados, el silenciamiento de genes múltiples logró acercarse al límite de la cantidad de malonil-CoA necesaria para producir el metabolito secundario específico de la planta (2S)-naringenina. Al acoplar las modificaciones genéticas al crecimiento celular, los efectos combinados de estas perturbaciones genéticas aumentaron el título final de (2S)-naringenina a 421,6 mg/L, que fue 7,4 veces mayor que la cepa de control (50,5 mg/L). La estrategia descrita aquí podría usarse para caracterizar genes que son esenciales para el crecimiento celular y para desarrollar E. coli como una fábrica celular bien organizada para la producción de otros productos importantes que requieren malonil-CoA como precursor, como flavonoides, policétidos y ácidos grasos. Los polímeros de alta resistencia, por ejemplo, las hebras de aramida, son materiales importantes en la innovación espacial. Para obtener estos materiales en áreas remotas, por ejemplo, Marte, la creación orgánica es intrigante. El precursor del polímero aromático, el ácido para-aminobenzoico (pABA), se puede obtener de la vía del shikimato a través del diseño metabólico de Bacillus subtilis, una forma de vida apropiada para la ciencia de ingeniería espacial. Nuestra técnica de construcción incluyó la reparación de la indol-3-glicerol fosfato sintasa defectuosa (trpC), la inactivación de una isoenzima de la corismato mutasa (aroH) y la sobreexpresión de la aminodesoxicorismato sintasa (pabAB) y la aminodesoxicorismato liasa (pabC) de los microorganismos Corynebacterium callunae y Xenorhabdus bovienii por separado. Además, se creó una proteína de fusión (pabABC) para desviar la transición de carbono. Utilizando el desarrollo versátil, se crearon fragmentos de la cepa de creación, listos para usar xilosa, para investigar y considerar el límite de creación de pABA a partir de varias fuentes de carbono. En lugar de la eficacia del sustrato o la ejecución de la ruta bioquímica, la toxicidad del producto, que estaba fuertemente sujeta al pH, parecía ser el factor limitante general. El título más notable alcanzado en frascos de batido fue de 3,22 gl−1 con un rendimiento de carbono de 12,4% [C−mol/C−mol] a partir de un aminoazúcar. Esto garantiza la idoneidad del sistema para el uso de activos in situ (ISRU) en biotecnología espacial.En este campo, las materias primas que se pueden obtener a partir de lisados ??de células cianobacterianas desempeñan un papel. Los plásticos y polímeros son omnipresentes en nuestra vida cotidiana y posiblemente tengan una importancia mucho mayor en la tecnología espacial. El tereftalato de polietileno biaxial (BoPET, nombre comercial Mylar®) es apreciado por su alta elasticidad, estabilidad química y dimensional, propiedades de resistencia y protección eléctrica; las capas de BoPET metalizado se utilizan, por ejemplo, en los aviones de gran altitud, así como en los trajes espaciales para la protección térmica y la resistencia a la radiación. Las aramidas, al igual que el tejido y el material laminar Kevlar®, presentan propiedades relativamente excepcionales, que incluyen alta resistencia y módulo de dureza, baja fatiga por flexión, así como excelente resistencia química y resistencia al calor y también resistencia a la radiación. Por lo tanto, son ideales para una variedad de aplicaciones fuertes, incluida la protección balística. El hecho de que estos materiales sean especialmente apropiados para el desarrollo de trajes y residencias naturales en la innovación espacial demuestra su uso en transbordadores inflables como los de Bigelow Aerospace® (NASA, 2017). Las materias primas de los polímeros aromáticos son normalmente derivados del petróleo, lo que no es posible a largo plazo en la Tierra, ni está disponible en el espacio o en objetivos como la Luna o Marte. La ingeniería metabólica puede proporcionar la tecnología para abordar este problema, al impulsar la creación de precursores de biorreemplazo a través del uso de activos in situ (ISRU). El ISRU tiene como objetivo utilizar la ciencia artificial para recargar productos en misiones de investigación del espacio profundo (Rothschild, 2016). Las vías metabólicas microbianas dan lugar a numerosos procesos que pueden reemplazar los brebajes sintéticos ya basados ??en el petróleo por otros de origen biológico o reemplazarlos por opciones de origen biológico. Esto incluye una gran cantidad de compuestos derivados de aromas y olores dulces (Averesch y Krömer, 2018). El ácido para-aminobenzoico (pABA), que es el núcleo de la ruta del shikimato, es uno de estos aromáticos con una relevancia variable: se utiliza como agente de reticulación para jugos y colorantes, precursor en la industria farmacéutica y como un remedio en sí mismo (por ejemplo, como el medicamento POTABA®). El pABA también se puede convertir en ácido tereftálico (Farlow y Krömer, 2016), como materia prima para la producción de PET/Mylar®. También podría ser posible transformar pABA en para-fenilendiamina (por ejemplo, mediante la reacción de Kochi o Hunsdiecker seguida de una sustitución nucleofílica), que es (además del ácido tereftálico) el segundo monómero de la fibra de aramida Kevlar®. Además, pABA también puede polimerizarse consigo mismo (Morgan, 1977), posiblemente produciendo una para-aramida con una estructura subatómica indiferenciada de Kevlar®.La posibilidad de crear pABA microbiológicamente para utilizarlo como precursor mecánico se indicó por primera vez utilizando la levadura Saccharomyces cerevisiae (Krömer et al., 2013), donde se alcanzó un título de 0,03 gl−1 (0,22 mM) utilizando glucosa como única fuente de carbono. En un estudio de seguimiento dedicado, el título pudo ampliarse a 0,22 gl−1 (1,57 mM) a partir de glicerol/etanol (Averesch et al., 2016). Además, se han utilizado organismos microscópicos para la creación de pABA. En Escherichia coli, se alcanzó una concentración de 4,8 gl−1 (35 mM) a partir de glucosa (Koma et al., 2014), mientras que la creación más notable hasta la fecha se cultivó con Corynebacterium glutamicum, llegando a 43,06 gl−1 (314 mM) a partir de glucosa (Kubota et al., 2016). Para utilizar esta tecnología en el espacio y, en última instancia, permitir la unión de las hebras de aramida, sería extremadamente atractivo crear pABA en Bacillus subtilis, la criatura más apta para la ciencia de ingeniería espacial. Bacillus subtilis estructura endosporas (Nicholson et al., 2000; Horneck et al., 2010), que son extremadamente impermeables a algunos parámetros naturales, por ejemplo, sequía, salinidad, pH y solventes y permanecen razonables durante un período de tiempo considerable; en la medida en que están protegidos de la radiación UV, incluso soportan el vacío de la habitación (Horneck, 1993). Biografía Jingwen Zhou obtuvo su doctorado en Ingeniería de Fermentación en 2009. Después de eso, se convirtió en Profesor Asistente en 2009, Profesor Asociado en 2011 y Profesor Titular en 2014 en la Escuela de Biotecnología de la Universidad de Jiangnan. Terminó su formación de Postdoctorado en el Departamento de Química y Biología Química en Harvard de 2012 a 2013. Sus trabajos de investigación actuales se centran principalmente en la ingeniería metabólica de microorganismos para producir ácidos orgánicos y productos naturales vegetales, especialmente ácido L-ascórbico y flavonoides. Publicó 52 artículos revisados ??por pares en revistas como Metabolic Engineering, Applied and Environment Microbiology, y también varias revisiones invitadas en Current Opinion in Biotechnology y Biotechnology Advances. Varios de los productos típicos en los que había estado trabajando ahora son producidos por varios fabricantes a escala industrial. Sus logros fueron premiados varias veces en China. Actualmente es miembro del consejo editorial de Scientific Reports (Nature Press) y Electronic Journal of Biotechnology (Elsevier Press).06 gl−1 (314 mM) a partir de glucosa (Kubota et al., 2016). Para utilizar esta innovación en el espacio y, en última instancia, potenciar la unión de las hebras de aramida, sería extremadamente interesante crear pABA en Bacillus subtilis, la criatura más apta para la ciencia de ingeniería espacial. Bacillus subtilis estructura endosporas (Nicholson et al., 2000; Horneck et al., 2010), que son extremadamente inmunes a algunos parámetros naturales, como la sequía, la salinidad, el pH y los disolventes, y se mantienen moderadas durante un período considerable de tiempo; en la medida en que están protegidas de la radiación UV, incluso soportan el vacío del espacio (Horneck, 1993). Biografía Jingwen Zhou obtuvo su doctorado en Ingeniería de Fermentación en 2009. Después de eso, se convirtió en Profesor Asistente en 2009, Profesor Asociado en 2011 y Profesor Titular en 2014 en la Escuela de Biotecnología de la Universidad de Jiangnan. Completó su formación de Postdoctorado en el Departamento de Química y Biología Química en Harvard de 2012 a 2013. Sus trabajos de investigación actuales se centran principalmente en la ingeniería metabólica de microorganismos para producir ácidos orgánicos y productos naturales vegetales, especialmente ácido L-ascórbico y flavonoides. Publicó 52 artículos revisados ??por pares en revistas como Metabolic Engineering, Applied and Environment Microbiology, y también varias revisiones invitadas en Current Opinion in Biotechnology y Biotechnology Advances. Varios de los productos típicos en los que había estado trabajando ahora son producidos por varios fabricantes a escala industrial. Sus logros fueron premiados varias veces en China. Ahora es miembro del Consejo Editorial de Scientific Reports (Nature Press) y Electronic Journal of Biotechnology (Elsevier Press).06 gl−1 (314 mM) a partir de glucosa (Kubota et al., 2016). Para utilizar esta innovación en el espacio y, en última instancia, potenciar la unión de las hebras de aramida, sería extremadamente interesante crear pABA en Bacillus subtilis, la criatura más apta para la ciencia de ingeniería espacial. Bacillus subtilis estructura endosporas (Nicholson et al., 2000; Horneck et al., 2010), que son extremadamente inmunes a algunos parámetros naturales, como la sequía, la salinidad, el pH y los disolventes, y se mantienen moderadas durante un período considerable de tiempo; en la medida en que están protegidas de la radiación UV, incluso soportan el vacío del espacio (Horneck, 1993). Biografía Jingwen Zhou obtuvo su doctorado en Ingeniería de Fermentación en 2009. Después de eso, se convirtió en Profesor Asistente en 2009, Profesor Asociado en 2011 y Profesor Titular en 2014 en la Escuela de Biotecnología de la Universidad de Jiangnan. Completó su formación de Postdoctorado en el Departamento de Química y Biología Química en Harvard de 2012 a 2013. Sus trabajos de investigación actuales se centran principalmente en la ingeniería metabólica de microorganismos para producir ácidos orgánicos y productos naturales vegetales, especialmente ácido L-ascórbico y flavonoides. Publicó 52 artículos revisados ??por pares en revistas como Metabolic Engineering, Applied and Environment Microbiology, y también varias revisiones invitadas en Current Opinion in Biotechnology y Biotechnology Advances. Varios de los productos típicos en los que había estado trabajando ahora son producidos por varios fabricantes a escala industrial. Sus logros fueron premiados varias veces en China. Ahora es miembro del Consejo Editorial de Scientific Reports (Nature Press) y Electronic Journal of Biotechnology (Elsevier Press).y también ha sido invitado a varias publicaciones en Current Opinion in Biotechnology y Biotechnology Advances. Varios de los productos típicos en los que había estado trabajando ahora son producidos por varios fabricantes a escala industrial. Sus logros fueron premiados varias veces en China. Actualmente es miembro del consejo editorial de Scientific Reports (Nature Press) y Electronic Journal of Biotechnology (Elsevier Press).y también ha sido invitado a varias publicaciones en Current Opinion in Biotechnology y Biotechnology Advances. Varios de los productos típicos en los que había estado trabajando ahora son producidos por varios fabricantes a escala industrial. Sus logros fueron premiados varias veces en China. Actualmente es miembro del consejo editorial de Scientific Reports (Nature Press) y Electronic Journal of Biotechnology (Elsevier Press).   zhoujw1982@jiangnan.edu.cn