Long Liu, Yanfeng Liu, Jianghua Li y Guocheng Du
La N-acetil glucosamina (GlcNAc) es un compuesto importante desde el punto de vista farmacéutico y nutracéutico con amplias aplicaciones y actualmente se produce principalmente por hidrólisis de caparazones de cangrejos y camarones, lo que puede causar una grave contaminación ambiental y tiene un riesgo potencial de reacciones alérgicas. En este trabajo, logramos la sobreproducción de GlcNAc mediante ingeniería metabólica de sistemas de Bacillus subtilis, una cepa generalmente considerada segura. Específicamente, la vía de síntesis de GlcNAc se fortaleció mediante la sobreexpresión conjunta de la glucosamina-6-fosfato (GlmS) sintasa y la GlcNAc-6-fosfato N-acetil transferasa (GNA1), que realizó la producción de GlcNAc (240 mg/L). A continuación, la vía de captación de GlcNAc y la vía de degradación intracelular se bloquearon por completo mediante la eliminación de todos los genes codificantes en la vía catabólica de GlcNAc para facilitar la acumulación de GlcNAc. Luego, para equilibrar y fortalecer la vía sintética de GlcNAc, se introdujo un sistema de andamiaje guiado por ADN y se aumentó el título de GlcNAc de 1,83 g/L a 4,55 g/L. Luego se emplearon ARN reguladores pequeños sintéticos para optimizar el nivel de expresión de enzimas clave en los nodos de la red relacionada con GlcNAc, incluida la 6-fosfofructoquinasa (Pfk) y la fosfoglucosamina mutasa (GlmM). El título de GlcNAc se mejoró a 8,30 g/L mediante la regulación modular de las actividades de los módulos relacionados con GlcNAc. En la fermentación por lotes alimentados, el título de GlcNAc se incrementó aún más a 31,65 g/L, que fue 3,8 veces el del matraz de agitación. Finalmente, para comprender la cinética de los cambios de metabolitos en la vía de síntesis de GlcNAc y la glucólisis, se implementaron metabolómica dirigida y etiquetado dinámico. La desfosforilación ineficiente de GlcNAc6P y la fosforilación no deseada de GlcNAc se identificaron como un paso limitante de la velocidad para la síntesis de GlcNAc, lo que señaló la dirección futura para una mayor optimización de la ruta. Las estrategias de ingeniería metabólica de sistemas utilizadas pueden ser útiles para la construcción de fábricas de células B. subtilis versátiles para la producción de otros productos químicos importantes a nivel industrial. Los polímeros de alta resistencia, como las fibras de aramida, son materiales importantes en la tecnología espacial. Para obtener estos materiales en lugares remotos, como Marte, la producción biológica es de interés. El precursor del polímero aromático, el ácido para-aminobenzoico (pABA), se puede derivar de la ruta del shikimato a través de la ingeniería metabólica de Bacillus subtilis, un organismo adecuado para la biología sintética espacial. Nuestra estrategia de ingeniería incluyó la reparación de la indol-3-glicerol fosfato sintasa defectuosa (trpC), la inactivación de una isoenzima de la corismato mutasa (aroH) y la sobreexpresión de la aminodesoxicorismato sintasa (pabAB) y la aminodesoxicorismato liasa (pabC) de las bacterias Corynebacterium callunae y Xenorhabdus bovienii respectivamente. Además, se creó una enzima de proteína de fusión (pabABC) para canalizar el flujo de carbono. Mediante evolución adaptativa, se crearon mutantes de la cepa de producción, capaces de metabolizar xilosa,para explorar y comparar la capacidad de producción de pABA a partir de diferentes fuentes de carbono. En lugar de la eficiencia del sustrato o el rendimiento de la ruta bioquímica, la toxicidad del producto, que dependía en gran medida del pH, pareció ser el factor limitante general. El título más alto alcanzado en matraces agitados fue de 3,22 gl−1 con un rendimiento de carbono del 12,4 % [C− mol/C− mol] a partir de un aminoazúcar. Esto promete la idoneidad del sistema para la utilización de recursos in situ (ISRU) en biotecnología espacial, donde las materias primas que se pueden derivar del lisado de células cianobacterianas desempeñan un papel. Los plásticos y polímeros no solo son omnipresentes en nuestra vida cotidiana, sino que potencialmente son de mayor importancia en la tecnología espacial. El tereftalato de polietileno orientado biaxialmente (BoPET, nombre comercial Mylar®) es valorado por su alta resistencia a la tracción, estabilidad química y dimensional, propiedades de barrera y aislamiento eléctrico; Las capas de BoPET metalizado se utilizan, por ejemplo, en globos de gran altitud, así como en trajes espaciales para el aislamiento térmico y la resistencia a la radiación. Las aramidas, como el tejido y el material laminar Kevlar®, presentan propiedades igualmente sobresalientes, que incluyen alta tenacidad y módulo de resistencia, baja fatiga por flexión, así como excelente estabilidad química y estabilidad térmica y también resistencia a la radiación. Por lo tanto, son ideales para una variedad de aplicaciones especiales, incluida la protección balística. El hecho de que estos materiales sean especialmente adecuados para la construcción de trajes ambientales y viviendas en la tecnología espacial demuestra su utilización en naves espaciales inflables como las de Bigelow Aerospace® (NASA, 2017). Las materias primas de los polímeros aromáticos se derivan comúnmente de combustibles fósiles, que no son sostenibles a largo plazo en la Tierra, ni están disponibles en el espacio o en destinos como la Luna o Marte. La ingeniería metabólica puede proporcionar la tecnología para resolver este problema, al permitir la producción de precursores de biorreemplazo a través de la utilización de recursos in situ (ISRU). La ISRU tiene como objetivo utilizar la biología sintética para reponer los productos básicos en las misiones de exploración del espacio profundo (Rothschild, 2016). Las vías metabólicas microbianas dan lugar a muchos compuestos que pueden sustituir potencialmente a los productos químicos actuales derivados del petróleo por otros de origen biológico o reemplazarlos por alternativas de origen biológico. Esto incluye una multitud de compuestos aromáticos y derivados de aromáticos (Averesch y Krömer, 2018). El intermedio de la vía del shikimato, el ácido para-aminobenzoico (pABA), es uno de estos aromáticos con una aplicabilidad versátil: se utiliza como agente de reticulación para resinas y colorantes, precursor en la industria farmacéutica y como un agente terapéutico en sí mismo (por ejemplo, como el fármaco POTABA®). El pABA también se puede convertir en ácido tereftálico (Farlow y Krömer, 2016), como materia prima para la producción de PET/Mylar®. También es posible convertir el pABA en para-fenilendiamina (p. ej.mediante la reacción de Kochi o Hunsdiecker seguida de sustitución nucleofílica), que es (además del ácido tereftálico) el segundo monómero de la fibra de aramida Kevlar®. Además, pABA también se puede polimerizar consigo mismo (Morgan, 1977), produciendo potencialmente una para-aramida con una estructura molecular análoga a Kevlar®. La viabilidad de producir pABA microbiológicamente para su uso como precursor industrial se demostró por primera vez utilizando la levadura Saccharomyces cerevisiae (Krömer et al., 2013), donde se alcanzó un título de 0,03 gl−1 (0,22 mM) utilizando glucosa como única fuente de carbono. En un estudio de seguimiento dedicado, el título podría aumentarse a 0,22 gl−1 (1,57 mM) a partir de glicerol/etanol (Averesch et al., 2016). Además, se han utilizado bacterias para la producción de pABA. En Escherichia coli, se alcanzó una concentración de 4,8 gl−1 (35 mM) a partir de glucosa (Koma et al., 2014), mientras que la producción más alta hasta la fecha se logró con Corynebacterium glutamicum, alcanzando 43,06 gl−1 (314 mM) a partir de glucosa (Kubota et al., 2016). Para aprovechar esta tecnología en el espacio y, en última instancia, permitir la síntesis de fibras de aramida, sería muy deseable producir pABA en Bacillus subtilis, el organismo más adecuado para la biología sintética espacial. Bacillus subtilis forma endosporas (Nicholson et al., 2000; Horneck et al., 2010), que son extremadamente resistentes a varios parámetros ambientales como sequía, salinidad, pH y solventes y permanecen viables durante décadas; siempre que estén protegidas de la radiación UV, incluso soportan el vacío del espacio (Horneck, 1993). Biografía Long Liu es actualmente profesor vitalicio en la Escuela de Biotecnología, Universidad de Jiangnan, Wuxi, China. Ha estado trabajando en el área de ingeniería de bioprocesos e ingeniería metabólica con especial referencia a la optimización y control de bioprocesos. Es autor de 2 libros, 3 capítulos de libros, 7 artículos de revisión, 20 patentes, 37 artículos de investigación en revistas SCI y 10 artículos de conferencias. Ha recibido el Primer premio de progreso científico y tecnológico en Jiangsu, China (2010), el Primer premio de progreso científico y tecnológico en la Federación de la Industria Química y del Petróleo de China (2011), el Premio a la Invención Tecnológica del Consejo Nacional de la Industria Ligera de China (2013) y el premio al Joven Profesor Excelente de Jiangsu, China (2014). longliu@jiangnan.edu.cnAdemás, se han utilizado bacterias para la producción de pABA. En Escherichia coli, se alcanzó una concentración de 4,8 gl−1 (35 mM) a partir de glucosa (Koma et al., 2014), mientras que la producción más alta hasta la fecha se logró con Corynebacterium glutamicum, alcanzando 43,06 gl−1 (314 mM) a partir de glucosa (Kubota et al., 2016). Para aprovechar esta tecnología en el espacio y, en última instancia, permitir la síntesis de fibras de aramida, sería muy deseable producir pABA en Bacillus subtilis, el organismo más adecuado para la biología sintética espacial. Bacillus subtilis forma endosporas (Nicholson et al., 2000; Horneck et al., 2010), que son extremadamente resistentes a varios parámetros ambientales como la sequía, la salinidad, el pH y los disolventes y permanecen viables durante décadas; Mientras estén protegidos de la radiación UV, incluso pueden soportar el vacío del espacio (Horneck, 1993). Biografía Long Liu es actualmente profesor vitalicio en la Escuela de Biotecnología de la Universidad de Jiangnan, Wuxi, China. Ha trabajado en el área de ingeniería de bioprocesos e ingeniería metabólica con especial referencia a la optimización y control de bioprocesos. Es autor de 2 libros, 3 capítulos de libros, 7 artículos de revisión, 20 patentes, 37 artículos de investigación en revistas SCI y 10 artículos de conferencias. Ha recibido el Primer premio de progreso científico y tecnológico, Jiangsu, China (2010), el Primer premio de progreso científico y tecnológico, Federación de la industria química y petrolera de China (2011), el Premio a la invención tecnológica del Consejo Nacional de la Industria Ligera de China (2013) y el premio al joven maestro excelente de Jiangsu, China (2014). longliu@jiangnan.edu.cnAdemás, se han utilizado bacterias para la producción de pABA. En Escherichia coli, se alcanzó una concentración de 4,8 gl−1 (35 mM) a partir de glucosa (Koma et al., 2014), mientras que la producción más alta hasta la fecha se logró con Corynebacterium glutamicum, alcanzando 43,06 gl−1 (314 mM) a partir de glucosa (Kubota et al., 2016). Para aprovechar esta tecnología en el espacio y, en última instancia, permitir la síntesis de fibras de aramida, sería muy deseable producir pABA en Bacillus subtilis, el organismo más adecuado para la biología sintética espacial. Bacillus subtilis forma endosporas (Nicholson et al., 2000; Horneck et al., 2010), que son extremadamente resistentes a varios parámetros ambientales como la sequía, la salinidad, el pH y los disolventes y permanecen viables durante décadas; Mientras estén protegidos de la radiación UV, incluso pueden soportar el vacío del espacio (Horneck, 1993). Biografía Long Liu es actualmente profesor vitalicio en la Escuela de Biotecnología de la Universidad de Jiangnan, Wuxi, China. Ha trabajado en el área de ingeniería de bioprocesos e ingeniería metabólica con especial referencia a la optimización y control de bioprocesos. Es autor de 2 libros, 3 capítulos de libros, 7 artículos de revisión, 20 patentes, 37 artículos de investigación en revistas SCI y 10 artículos de conferencias. Ha recibido el Primer premio de progreso científico y tecnológico, Jiangsu, China (2010), el Primer premio de progreso científico y tecnológico, Federación de la industria química y petrolera de China (2011), el Premio a la invención tecnológica del Consejo Nacional de la Industria Ligera de China (2013) y el premio al joven maestro excelente de Jiangsu, China (2014). longliu@jiangnan.edu.cnPrimer premio de Progreso en Ciencia y Tecnología, Federación de la Industria Química y del Petróleo de China (2011), Premio a la Invención Tecnológica del Consejo Nacional de la Industria Ligera de China (2013) y Premio a la Excelencia Docente Joven de Jiangsu, China (2014). longliu@jiangnan.edu.cnPrimer premio de Progreso en Ciencia y Tecnología, Federación de la Industria Química y del Petróleo de China (2011), Premio a la Invención Tecnológica del Consejo Nacional de la Industria Ligera de China (2013) y Premio a la Excelencia Docente Joven de Jiangsu, China (2014). longliu@jiangnan.edu.cn
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