Abstracto

Biotecnología-2013: Optimización de la expresión génica transitoria (TGE) con una estrategia de alimentación de peptona para la producción de proteínas recombinantes en cultivos de células de mamíferos - Fatemeh Davam Pasteur - Instituto de Irán

Fatemeh Davam Pasteur 

 Resumen: En la actualidad, cerca del 60-70% de las proteínas recombinantes se producen correctamente en células CHO. La optimización de las condiciones de subcultivo celular para el aumento y la productividad de células de ovario de hámster chino (CHO) recombinantes es un paso esencial en la fabricación biofarmacéutica. La expresión breve de la proteína (expresión génica temporal) TGE es la forma preferida de expresar proteínas recombinantes en un corto período de tiempo y a una escala apropiada para pruebas premédicas. En el presente estudio, se evaluó el efecto de la optimización de las condiciones de transfección en un medio libre de suero CD DG44 en una incubadora con agitación con células CHO DG44 en estado suspendido. Se estudió un rango de valores para ADN, PEI y conciencia celular para encontrar los mejores valores en cuanto a eficiencia de transfección. Los resultados confirmaron que los valores optimizados fueron 1,5 μg/106 células de reactivo de transfección (PEI), 0,5*106 células para densidades celulares iniciales y 2 μg/106 células de ADN con un rendimiento de transfección de 28,71, 38,68 y 52,8% respectivamente. Además, con base en esas condiciones optimizadas de TGE, se evaluó el efecto de la alimentación con 6 peptonas exclusivas de caseína y soja sobre el rendimiento de transfección. Los resultados de la alimentación con peptonas caseína triptona N1, peptona de soja A2Sc y peptona de soja E110 mostraron una eficiencia de transfección de 59,88,%, 58,28% y 68,66% con un crecimiento de 15,44, 12,35 y 28,55% en comparación con el proceso optimizado anterior. Estos datos indican que el mejor enfoque de alimentación es capaz de aumentar el rendimiento de la transfección y es un enfoque prometedor para optimizar el proceso de TGE. Durante la última década, la TGE ha sido un método ampliamente utilizado para la fabricación rápida de proteínas recombinantes en células de mamíferos. A pesar de varias investigaciones realizadas para mejorar esta tecnología en términos de escalabilidad y productividad, los mejores rendimientos de producción de TGE generalmente siguen siendo más bajos en comparación con los valores logrados con cepas celulares estables. Teniendo en cuenta la importante posición de las células CHO como el huésped más común para la fabricación de proteínas curativas, es preferible tener un enfoque de TGE optimizado para la generación de una cantidad suficiente de proteína recombinante para investigaciones preclínicas. De esta manera, no es necesario que los grupos biofarmacéuticos reemplacen su línea celular fuente preclínica de proteína recombinante por otra línea celular transfectada de manera estable para el producto final. El rendimiento de la transfección es uno de los factores vitales que afectan los resultados de la TGE. Se ha demostrado que la optimización de la cantidad de reactivo de transfección PEI, densidades celulares iniciales y plásmido de ADN tiene excelentes resultados en las eficiencias de transfección. Sin embargo, en general los estudios de optimización se han realizado en la línea celular HEK (con mejores índices de transfección) y los pocos estudios en la línea celular CHO aún no han tenido éxito en alcanzar valores tan altos como los de las células HEK.La condición optimizada también depende del tamaño y las características del plásmido de ADN y su compatibilidad con la línea celular, por lo que es fundamental establecer un método de TGE optimizado para cada proteína recombinante objetivo. La alta densidad celular utilizada durante la transfección aumenta la posibilidad de exposiciones celulares a poliplexos de PEI-ADN y, en las condiciones hipotérmicas de la vida, las células persistirían en agotamientos de nutrientes ya que están bloqueadas en una fase G1 con menor demanda de vitaminas. La expresión génica temporal (TGE) es una tecnología bien instalada para la producción rápida de cantidades de miligramos a gramos de proteínas recombinantes en líneas celulares de riñón embrionario humano (HEK) y ovario de hámster chino (CHO) (1-3). Debido a la breve rotación y al precio del café, la plataforma TGE desempeña un papel más importante en las etapas iniciales de desarrollo biofarmacéutico por dos razones; en primer lugar, es fundamental que las grandes corporaciones biofarmacéuticas muestren más de un candidato a fármaco antes de avanzar hacia la línea de desarrollo formal. Teniendo en cuenta que las células CHO son los principales huéspedes de la producción de proteínas recombinantes en las empresas biofarmacéuticas de vanguardia, sería útil optimizar la técnica de TGE para esta línea celular para poder extrapolar los datos para el desarrollo estable de líneas celulares. Debido a los numerosos riesgos asociados con el uso de suero en cultivos celulares, los bioprocesos industriales ahora se basan básicamente en medios sin suero (SFM) y, con mayor frecuencia, en medios sin aditivos animales, que tienen ventajas económicas y de seguridad sobre los productos derivados de animales. La necesidad de limitar los aditivos derivados de animales en el proceso de fabricación ha creado un interés en el uso de hidrolizados de proteínas (peptonas) como suplementos alternativos para actualizar el suero. Las peptonas son hidrolizados proteicos solubles en agua de naturaleza no descrita químicamente, que contienen péptidos, aminoácidos y sales inorgánicas, pero sin lípidos ni azúcares. (11) Esta categoría de componentes de los medios son vitaminas de bajo valor y de mayor venta para cultivos celulares animales en profundidad que proporcionan vitaminas o análogos de sustancias activas en función del grado de hidrólisis (2, 12). Varias peptonas están disponibles comercialmente, incluyendo el digerido de tejidos de res, carne, caseína, lactoalbúmina y levadura. La principal desventaja de la mayoría de estas peptonas es su origen animal, lo que pone en peligro la bioseguridad del medio. Se ha demostrado que la suplementación de medios preferidos sin proteínas con peptonas provoca un gran aumento en la productividad de TGE en células HEK 293-EBNA (13, 14). Este efecto también se ha estudiado en cepas celulares sólidas CHO (15, 16). Sin embargo, hasta donde sabemos, aún no se ha realizado ningún estudio para investigar el efecto de los suplementos de peptona en las células CHO en la expresión temporal de proteína recombinante. En este estudio,Se hicieron esfuerzos para seleccionar la situación de TGE de primera clase con respecto a PEI, reconocimiento de ADN y densidad celular. Además, se aplicó una estrategia de alimentación para la línea celular CHO DG44 recombinante para producir una forma quimérica-truncada única de activador de plasminógeno tisular. A pesar de los rendimientos mejorados de TGE descritos en el documento, también vale la pena mencionar que el paso regular del cultivo de células y el manejo limpio de la solución madre de PEI deben desempeñar un papel crucial para lograr altas eficiencias de transfección y títulos de proteína recombinante. Además, todavía hay cuellos de botella que consisten en la necesidad de intercambio de medios durante la transfección o reconocimiento de células antes de la transfección, que es importante tener en cuenta para que pueda convertirse en un enfoque de alto nivel. f.davami@gmail.com