Abstracto

Biotecnología-2013: Cultivo de embriones ovinos, caprinos y bovinos de diferentes grados de calidad en TCM-199 y BAF en una incubadora de CO2 al 5% - Daniel M Barry - Universidad de Venda

 Daniel M. Barry

Después de la selección de organismos no desarrollados de animales domésticos entregados in vivo, generalmente se evalúan bajo alta amplificación (menos de 80X) con la guía de una lupa convertida o de sistema de sonido. Los organismos no desarrollados de Grado 1 darán los mejores resultados de originación cuando se transfieran a animales beneficiarios de sincronización, mientras que los organismos incipientes de Grado 3 darán los resultados más notablemente terribles. El objetivo del presente estudio fue cultivar cada una de las tres evaluaciones de calidad de organismos incipientes en etapa de mórula precompactados entregados in vivo de ovejas, cabras y animales lecheros en dos medios de cultivo diferentes y luego evaluar el desarrollo de los organismos no desarrollados evaluando la cantidad de organismos no desarrollados que llegan a la etapa de blastocisto producido. Los resultados indicaron que no hubo diferencias significativas entre el desarrollo de los microorganismos no desarrollados de Grado 1 y Grado 2 de ninguna de las tres especies cuando se refinaron en TCM-199 o líquido amniótico tipo buey (BAF) inactivado por calor en la etapa temprana del embarazo (<60 días) como medios de cultivo. Sin embargo, se desarrollaron más microorganismos incipientes de oveja, cabra y bovino en etapa de mórula precompactados de Grado 3 generados in vivo, generados hasta la etapa de blastocisto incubado cuando se refinaron en BAF con 10% FBS y agentes antiinfecciosos, en comparación con el cultivo en TCM-199 con 10% FBS y antimicrobianos (p<0,05). Materiales y métodos Cultivo celular: los OLG se separaron de los cerebros de ovejas de 4 a 6 meses como ya se describió. Las células recién confinadas, banda III (ver Szuchet et al., 1980, para más detalles) se sembraron en placas de cultivo de plástico a 2 x 106 células/ml. Aproximadamente el 40% de las células se adhirieron a la placa; el resto de las células formaron pequeños racimos desprendidos. Estos últimos se denominan B3.f OLG (Szuchet y Yim, 1984). Después de 4-5 días, se recogió el sobrenadante que contenía B3.f OLG y se centrifugó. Las células del sedimento se resuspendieron en medio de cultivo y se volvieron a sembrar en placas de Petri revestidas con polilisina sobre cuyo exterior se adhirió el OLG. Las últimas células se denominan B3 fA (A de seguidor). B3. Los OLG fA se mantuvieron en medio de Eagle modificado por Dulbecco mejorado con suero de potro al 20 %, glutamina 2 mM y antitoxina (0,3 µg/ml de anfotericina B y 2,4 µg/ml de garamicina). Las colonias se trataron dos veces por semana. La pureza del cultivo se determinó en un 98-99 % utilizando una respuesta inmune monoclonal contra galactocerebrósido (una bendición del Dr. B. Ranscht), así como una respuesta inmune policlonal contra 2',3'-nucleótido cíclico 3'-fosfohidrolasa (una bendición del Dr. T. Sprinkle). Las células se analizaron 2-14 días después de la conexión. Los flujos celulares completos Los pulsos de voltaje positivo del potencial de retención (-80 mV) activaron una corriente de salida dependiente del voltaje y del tiempo en los OLG refinados. Los registros completos del voltaje de cierre celular de un OLG después de 4 días en cultivo discípulo se pueden encontrar en la Figura 2.La parte transitoria de la corriente se desactivó en la capacidad de retención despolarizada de - 40 mV, dejando un segmento de estado constante de suficiencia variable (Fig. 2B). La Figura 2C muestra la relación corriente-voltaje máximo para los flujos delineados en la Figura 2, A y B. En general, la relación corriente-voltaje para la corriente transitoria o máxima se mantuvo constante con el tiempo después de la formación de todo el arreglo de celdas, lo que permitió de 3 a 5 minutos para el ajuste introductorio. La selectividad iónica del segmento transitorio de la corriente de salida se resolvió a partir de la inversión de los flujos de cola en el rango de 5,4 mM de K+ externo. El potencial de película se cambió primero a 120 mV durante 10 ms (Fig. 3A) y luego se aventuró de nuevo a diferentes posibilidades de prueba. La relación corriente-voltaje momentánea (5 ms después del inicio de los flujos de cola) muestra que el potencial de inversión fue de - 66,2 f 1,45 mV (4). El potencial de inversión determinado para canales específicos de K+ impecables es de -82 mV. Al aumentar la [K], de 5,4 a 35 mM K+, el potencial de inversión se elevó a -19,8 mV (2). La evidencia que respalda las percepciones de que la corriente de salida activada por voltaje está formada por más de una conductancia proviene de las investigaciones de los flujos de OLG en varias ocasiones en el cultivo. Dentro de las 48 horas posteriores a la siembra, B3.fA OLG comenzó a generar procesos y expresar flujos de salida controlados por voltaje. Después de una semana en el cultivo, el segmento transitorio de la corriente de salida parecía disminuido. Esta disminución a menudo se acompañaba de un aumento en el estado constante o segmento no inactivante de la corriente de salida. Además, hubo un aumento en la corriente rectificadora interna como se muestra en la Figura 9. En una serie de 85 estudios, encontramos que el 88% (30/34) de las células con formas después del día 7 del cultivo de seguimiento desarrollaron rectificador interno en comparación con el 18% (5/28) de las células en los días 1-3 y el 26% (6/23) en los días 4-7. La diferencia en la frecuencia del rectificador interno en las células antes del día 7 y después del día 7 en el cultivo de seguimiento fue excepcionalmente grande (p < 0,001 según el análisis x2). Curiosamente, el 57% (4/7) de esas pocas células que permanecieron sin formas después de catorce días en el cultivo mostraron películas rectas de alta resistencia. Las propiedades electrofisiológicas de los OLG se examinaron con la configuración celular completa de la estrategia de fijación de voltaje del ánodo fijo. Los análisis en este estudio muestran la presencia de una corriente de salida subordinada al voltaje y una corriente rectificadora interna que son específicas de K+. La corriente de salida dependiente del voltaje probablemente representa una reacción compuesta de dos conductancias separadas. Esto parece diferente en relación con los informes de Bevan y Raff (1985) y Bevan et al. (1986), quienes no descubrieron conductancias subordinadas al voltaje en los OLG. Kettenmann et al. (1984a) observaron una pequeña dependencia del voltaje en sus investigaciones de un solo canal de OLG (el cambio normal en PO fue de 0,08 f 0,04 por paso de 10 mV).No pudimos demostrar un trabajo para Caz+ en el inicio de los flujos de K+ ya que (1) el bloqueador de corriente de calcio cadmio no tuvo impacto (Brown y Griffith, 1983; Galvan y Sedlmeir, 1984; Beluzzi et al., 1985b).daniel.barry@univen.ac.za