Abstracto

Biotecnología-2013: C-SLGE- Clonación del gen de la lipasa de Saccharomyces cerevisiae en E. coli nissle 1917 (probiótico) - Gadangi Indira - Universidad de Kakatiya

 Indira Gadangi

 Las enzimas lipasas pueden aumentar el valor nutricional de los alimentos y desempeñar papeles cruciales en la digestión, el transporte y el procesamiento de los lípidos nutricionales (por ejemplo, triglicéridos, grasas, aceites) en la mayoría, si no en todos, los organismos vivos. Escherichia coli Nissle 1917 es un microorganismo probiótico formador de esporas. En este estudio, nos propusimos clonar y especificar el gen de la lipasa en E. coli Nissle 1917 para crear mejores probióticos. El gen de la lipasa de Saccharomyces cerevisiae se clonó e insertó en el vector pUC18 y luego se transfirió a E. coli mediante transformación. El inserto y el análisis de PCR de pUC18 de E. coli Nissle 1917 recombinante mostraron el fragmento del gen de la lipasa en la electroforesis en gel de agarosa y se encontró que tenía casi 1,4 kb. El gen de la lipasa clonado en E. coli Nissle 1917 confirmó la actividad de la enzima lipasa mientras se cultivaba en un medio suplementado con suministro de lípidos. Se examinó la actividad de la lipasa en la E. coli recombinante Nissle 1917 en placas de prueba a diferentes pH (4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) para obtener cualquier cambio en el pH máximo de la enzima en el nuevo huésped y se determinó que la actividad de la lipasa era mayor en las placas de pH ácido que en las de pH normal y se encontró que el pH máximo era 6. El vector elegido para el desarrollo de la biblioteca de levadura fue el plásmido híbrido YCp5O (Fig. 1). YCp5O contiene el punto de inicio de replicación de pBR322 y los genes para Ampr y Tetr. La inserción en el sitio BamHI de YCp5O produce el plásmido Tets. YCp5O también contiene un replicador de levadura, ARSI, y un marcador seleccionable en levadura, URA3. Posteriormente, el plásmido contiene el fragmento CEN4 de levadura de 1,8 kb que contiene el centrómero del cromosoma IV. Elegimos utilizar el plásmido que contiene centrómeros porque las frecuencias de transformación y la estabilidad de los transformantes obtenidos son mayores que con los vectores que contienen ARS o 2, um. Esto tiene el importante resultado de que cada uno de los dos cambios de levadura necesarios para separar y caracterizar los genes se mejora en al menos un día. Además, al principio, no sabíamos si el gen CDC8 podría ser letal en dosis altas de genes. YCp5O tiene un número de duplicados de 1. La biblioteca se construyó mediante una pequeña modificación del procedimiento de Nasmyth y Reed (21), como se define en los materiales y técnicas. Dado que el grupo contenía al menos 1,7 x 104 clones recombinantes, hay aproximadamente seis genomas de levadura en esta biblioteca. Aislamiento de plásmidos que contienen CDC8. Cuando se utilizó para convertir CLK6 ura3 cdc8, el ADN organizado a partir del grupo híbrido de levadura YCp5O produjo aproximadamente 103 transformantes URA+ según ug, de los cuales el 0,04% pudo desarrollarse a la temperatura no permisiva (37 °C). El ADN se organizó a partir de 4 de los transformantes URA' CDC' de levadura y se introdujo en E. coli mediante transformación a resistencia a la ampicilina. El ADN plasmídico se preparó a partir de transformantes Ampr y se analizó mediante digestión con endonucleasa de restricción observada mediante electroforesis en gel de agarosa.Dado que los cuatro plásmidos tenían mapas de enzimas restrictivas iguales, el más simple, Y, hemos clonado un gen que potencia los mutantes cdc8 y este está físicamente relacionado con el locus SUP4. La posición del mapa del gen clonado confirma su identidad con el gen CDC8. La biblioteca que hemos descrito aquí también debería ser útil para clonar genes que serían letales en dosis altas; la transformación de alta frecuencia se realiza con el vector centrómero; sin embargo, la variedad de réplica intracelular es 1. Un hallazgo interesante es que el fragmento mínimo capaz de complementar la mutación cdc8 tiene una longitud de 750 pb. Esto se debe a que los plásmidos que contienen este pequeño inserto pudieron transformarse con la misma alta frecuencia que los plásmidos que contienen CDC8. El plásmido pSU4 se escindió con la nucleasa restrictiva BamHI y el fragmento que contiene los genes SUP4 y CDC8 se volvió a clonar en el plásmido YCp5O. El YCp5O se digirió con la endonucleasa BamHI y se trató con fosfatasa alcalina para evitar la ligadura del ADN del vector en ausencia de un inserto. Las ligaduras se realizaron en un día a 15 °C, utilizando la ADN ligasa T4; el agregado de reacción contenía 1 µg de ADN del vector y 0,5 µg de pSU4 en 50 µl de 66 mM de Tris-clorhidrato (pH 7,6)-66 mM de MgCl2-10 mM de ditiotreitol-1 mM de ATP. Se demostró que el plásmido resultante, YCp5O-S4 CDC8, contenía sitios BamHI, y la orientación del fragmento insertado se determinó con la ayuda del análisis de digestión con endonucleasas de restricción. Dado que los segmentos grandes de ADN flanqueantes son grandes, parece probable que este fragmento contenga el gen CDC8 completo. Sin embargo, una región codificante de este tipo normalmente solo daría una proteína de 27 000 dalton. Mediante ensayos de complementación, otros han purificado la proteína CDC8 hasta homogeneidad y han descubierto un peso molecular monomérico de 34.000 a 40.000 (1). Por lo tanto, es posible que hayamos identificado un fragmento de la proteína CDC8 que esté activo ya sea por sí mismo o complementando a la proteína sensible a la temperatura en el mutante. (La posibilidad de que el pequeño fragmento del gen esté dando lugar a transformantes a 370 °C mediante la característica distintiva de la recombinación entre el plásmido y el gen mutante en lugar de la complementación se hace improbable por la alta frecuencia de transformación y por el hecho de que las células que han segregado el fenotipo URA+ después del crecimiento en un medio rico vuelven a ser sensibles a la temperatura y que esta segregación se produce con la frecuencia característica de la pérdida autónoma del plásmido en lugar de la falta de plásmidos incluidos). La secuenciación de nucleótidos del pequeño fragmento y la purificación del producto del gen CDC8 sobreproducido a partir de células que contienen el plásmido CDC8 deberían resolver estas cuestiones. Biografía Gadangi Indira completó su doctorado sobre el estudio integral de la dermatofitosis del distrito de Warangal, AP de la Universidad de Kakatiya y actualmente está trabajando en un importante proyecto de investigación financiado por UGC.Es la directora del Departamento de Microbiología en Pingle Govt UG and PG College en Warangal. Ha publicado más de 15 artículos en revistas de prestigio y actas de seminarios nacionales e internacionales. gadangi.indira@gmail.com