Abstracto

Biotecnología-2013: B-cert: Un programa de capacitación para productores de plantas bioingenieras - Ronnie W. Heiniger - Universidad Estatal de Carolina del Norte

 Ronnie W. Heiniger

 La introducción de plantas genéticamente modificadas (GM) que producen proteínas que tienen usos farmacéuticos para mejorar la salud humana o reducir enfermedades depende de sistemas de producción capaces de producir estas plantas GM en condiciones controladas que impidan el movimiento de materiales genéticos desde la planta objetivo al medio ambiente. Como resultado de la preocupación pública sobre la gestión de la biotecnología en los EE. UU., USDA-APHIS desarrolló el programa Biotechnology Quality Management System (BQMS). BQMS es un programa federal diseñado para mejorar la gestión de organismos GM a través de educación intensiva, monitoreo y supervisión de todos los aspectos del proceso desde el laboratorio hasta el campo. El Programa BQMS ayuda a las organizaciones involucradas en la investigación y el desarrollo de biotecnología, incluidas las pequeñas empresas y los investigadores académicos, a analizar los puntos críticos de control dentro de sus sistemas de gestión para mantener un mejor cumplimiento con las regulaciones de APHIS (7 CFR parte 340) para la importación, el movimiento interestatal y la liberación en el campo de organismos genéticamente modificados (GM) regulados. Lamentablemente, el programa BQMS no aborda uno de los eslabones más importantes en el proceso de producción: el cultivador. Para corregir esta deficiencia, la Universidad Estatal de Carolina del Norte, en cooperación con el Centro de Biotecnología de Carolina del Norte y la Corporación de Desarrollo Económico del Noreste, han desarrollado un programa de certificación de productores llamado B-Cert. El programa B-Cert reúne los procedimientos necesarios para evitar la pérdida de material genético del sitio de destino, los estándares de certificación y los requisitos establecidos por el USDA-APHIS para el cultivo de cultivos transgénicos con el fin de desarrollar pautas y estándares para el manejo de cultivos, requisitos de aislamiento, saneamiento de equipos, salvaguardas ambientales, requisitos de mantenimiento de registros y otros procesos críticos. Hemos expresado viscum de longitud completa en PCP de N. tabacum y hojas de N. benthamiana en rangos de hasta 7 mg/kg de producto purificado. La expresión de las cadenas A y B también fue posible en ambos sistemas, pero el rendimiento del producto heterodimérico se redujo hasta en 0,97 g/g, mientras que la expresión de una cadena por sí sola no produjo cantidades cuantificables de proteína recombinante. El rendimiento de la viscumina de ciclo completo se volvió comparable con el de las lectinas vegetales expresadas en levadura, pero ~6 veces menor que el de las cadenas A y B de viscumina replegadas expresadas en E. coli. Sin embargo, el proceso bacteriano tiene una curación baja, requiere una dilución generalizada y es complejo, mientras que el proceso basado en plantas cubrió solo la mitad del número de pasos. Según una comparación de costos inmediata entre los dos métodos, el proceso de expresión en plantas es actualmente un 50% más económico, pero pequeñas mejoras en el rendimiento pueden reducir los costos de producción hasta en un ~88%. En comparación con el hospedador nativo V. album, el proceso de expresión heteróloga redujo el tiempo de espera en varios años.La contención expandida, además del rendimiento de área-tiempo, facilitó las modificaciones de productos específicos. Por lo tanto, la generación de viscumina recombinante en la vida vegetal es una oportunidad beneficiosa tanto para las estructuras microbianas como para las nativas. Expresamos transitoriamente la viscumina de duración completa (visFL), utilizando el UTR 5' local y la secuencia codificante, integrados en el ensamblaje pTRAc™ visFL. Además, expresamos la serie a individual (visA) mediante el uso del constructo pTRAc™ CHSLPH™ visAA™ S, o la serie a junto con la cadena B separada (visB) mediante el uso del constructo pTRAc™ CHSLPH™ visBA™ S tanto en N. tabacum mediante 2 PCP (figura 2a) como en las hojas de flores intactas de N. benthamiana (figura 2b) mediante infiltración con A. tumefaciens. Las construcciones de cadena única visA y visB transportaron un péptido señal recombinante para la secreción en el apoplasto de la planta intacta o en el área extracelular de células en suspensión de 2 a 3 para evitar la autointoxicación inmediata del respectivo huésped. Detectamos una banda de ~30 kDa en todas las muestras mediante análisis de transferencia Western 5 días después de la infiltración (dpi) utilizando un anticuerpo monoclonal (mAb) TA-5 de secuencia única. Esta banda migró ligeramente más lento que el víscera bacteriana no glicosilada en una cadena conocida (~28 kDa). Correspondió a la longitud esperada de la secuencia de viscumina a N-glicosilada (~30 kDa) que incorpora la masa del polipéptido más 1,9 kDa que representan un simple glicano N-glicano añadido a un único sitio aceptor esperado (Chauhan, Rao y Raghava, 2013). Dicha glicosilación se esperaba debido a la focalización vacuolar (Strasser, 2014) a través de una secuencia de señal interna de la toxina sazonada (Frigerio et al., 2001). El mayor rendimiento de la serie de viscumina a, en relación con las unidades de infiltración alternativas, se detectó en las muestras de visFL. En los PCP y las hojas intactas, las proporciones visFL:visA + visB:visA para el rendimiento de la serie a de viscumina fueron 6,8:4,0:1,0 y 35:3,5:1,0, respectivamente. En las muestras de PCP visFL y visA + visB, también detectamos una banda de ~65 kDa correspondiente al tamaño esperado de un heterodímero de viscumina N-glicosilado o un homodímero de la serie, como se mencionó anteriormente en E. coli (Kourmanova et al., 2004). Además del diseño del gen (cadena completa frente a cadenas separadas), la diferencia en los péptidos señal y los 5' UTR puede haber afectado también a los rendimientos de la serie A determinados para las tres configuraciones de expresión (Jansing y Buyel, 2018; Meshcheriakova, Saxena y Lomonossoff, 2014). Las bajas concentraciones absolutas de proteína también pueden haber evitado la detección de dímeros en las muestras de visA. Biografía Ronnie W. Heiniger es profesor en el Departamento de Ciencias de los Cultivos de la Universidad Estatal de Carolina del Norte. Recibió su doctorado en ecología de cultivos de la Universidad Estatal de Kansas en 1994.Heiniger ha trabajado durante los últimos 15 años como especialista en investigación y extensión en el Centro de Investigación y Extensión Vernon G. James en Plymouth, Carolina del Norte. Heiniger es conocido por su investigación aplicada y ha publicado más de 30 artículos en revistas y presentado trabajos que cubren su trabajo en agricultura de precisión y manejo de cultivos. Heiniger ha recibido el premio Gerold O Mott por investigación destacada de la Sociedad Estadounidense de Agronomía y es miembro de la Academia de Especialistas Destacados en Extensión de la Universidad Estatal de Carolina del Norte.                                                                                                                                                                                                                                                             Ron_Heiniger@ncsu.edu