Guido Krupp
Resumen La disponibilidad de ARNm sintéticos de alta calidad (syn-mRNA) ha permitido el progreso en sus aplicaciones. El creciente interés de los inversores privados y las grandes farmacéuticas ha creado un nuevo negocio de miles de millones de dólares. Se produjo una situación poco común en la que dos empresas alemanas se encuentran entre los tres principales actores en el campo. Amptec reconoce su obligación de apoyar a los nuevos actores proporcionando productos de ARNm personalizados y de alta calidad. Los requisitos en la aplicación de la manipulación de células mediada por ARNm fueron (i) expresión de antígenos en células dendríticas para vacunación en oncogénesis, prevención de enfermedades infecciosas y alergias; (ii) reprogramación de fibroblastos a células madre pluripotentes inducidas con diferenciación posterior al tipo de célula deseado; (iii) aplicaciones en terapia génica. Una descripción general reciente presenta las aplicaciones y los requisitos de calidad correspondientes del ARNm-sin. Los ARNm-sin se pueden generar mediante transcripción in vitro (IVT) a partir de plantillas que contienen el gen sintético. En principio, se pueden utilizar plásmidos linealizados como plantillas. Sin embargo, este procedimiento se ve obstaculizado por varias desventajas, como la escisión incompleta del plásmido, lo que da como resultado una reproducibilidad deficiente; y altas cantidades de ADN plasmídico que introducen componentes bacterianos no deseados con posibles complicaciones en las aplicaciones in vivo. Además, la actividad óptima del ARNm depende de una cola poli (A) muy larga y sin enmascarar, idealmente de 120 nucleótidos de longitud. Pero las repeticiones homopoliméricas largas son inestables en las células bacterianas. Hemos desarrollado un procedimiento alternativo, con productos de PCR bien definidos como plantillas IVT. Se presenta este enfoque y los requisitos de calidad detallados para los ARNm sintéticos. Se muestran los problemas que se observaron en la síntesis de ARNm basada en IVT, combinados con las soluciones a los problemas. En vista de las nucleasas diseñadas o bacterianas, la mejora de los avances en la alteración del genoma ha abierto la posibilidad de centrarse legítimamente en las sucesiones genómicas y ajustarlas en prácticamente todas las células eucariotas. La alteración del genoma ha ampliado nuestra capacidad para explicar la relación de las características genéticas con las enfermedades, al impulsar la creación de modelos celulares y animales cada vez más precisos de los procesos neuróticos, y ha comenzado a mostrar un potencial excepcional en una variedad de campos, que van desde la investigación esencial hasta la biotecnología aplicada y la investigación biomédica. El avance continuo en el desarrollo de nucleasas programables, por ejemplo, las nucleasas de dedos de zinc (ZFN), las nucleasas efectoras similares a activadores de interpretación (TALEN) y las nucleasas relacionadas con Cas con repetición palindrómica corta agrupada y espaciada automáticamente (CRISPR), ha acelerado enormemente el avance de la alteración de la calidad desde la teoría hasta la práctica clínica. Aquí, examinamos los avances actuales de las tres principales tecnologías de alteración del genoma (ZFN, TALEN y CRISPR/Cas9) y analizamos los usos de sus reactivos secundarios como herramientas de alteración de la calidad en diferentes enfermedades humanas y posibles tratamientos futuros, centrándonos en las células eucariotas y los modelos animales. Por último,A continuación, se presenta un esquema de los avances clínicos en la aplicación de las técnicas de modificación del genoma para el tratamiento de enfermedades y algunos de los desafíos en la implementación de esta tecnología. En los últimos años, el desarrollo desbordante de la modificación del genoma ha cambiado la investigación sobre el genoma humano, lo que ha permitido a los investigadores comprender con mayor probabilidad la participación de un solo elemento genético en una enfermedad en un ser vivo. Durante la década de 1970, el avance del diseño genético (control del ADN o ARN) estableció un nuevo límite en la edición del genoma.1 Basados ??en nucleasas artificiales o bacterianas, los avances en la edición del genoma se han desarrollado a un ritmo rápido durante los últimos años y han comenzado a mostrar una utilidad poco común en diferentes campos, que van desde la investigación fundamental hasta la biotecnología aplicada y la investigación biomédica.2 La alteración del genoma se puede lograr in vitro o in vivo mediante la entrega del hardware de alteración in situ, que efectivamente agrega, elimina y "enmienda" cualidades, así como realiza otras modificaciones genómicas altamente específicas.3,4 Las modificaciones de ADN dirigidas comienzan con la era de las roturas dobles libres (DSB) activadas por nucleasas, que conducen a la activación de componentes de recombinación altamente eficientes del ADN celular en células de mamíferos.5,6 Las DSB de ADN activadas por nucleasas se pueden reparar mediante una de las dos herramientas principales que se encuentran en prácticamente todos los tipos de células y animales: reparación coordinada por homología (HDR) y La unión de extremos no homólogos (NHEJ, por sus siglas en inglés)7 se produce en la incorporación dirigida o en interrupciones de la calidad, por separado. De hecho, la recombinación homóloga (HR), en la que se utilizan fragmentos de ADN homólogos intactos como formatos, ha sido la forma de abordar la comprensión centrada en la expansión, sustitución o inactivación de la calidad; sin embargo, el uso de la HR está fuertemente limitado debido a su desperdicio en células de mamíferos y organismos modelo.8 Después de que se descubrió que las DSB podían aumentar la frecuencia de HDR en varios niveles significativos, se encontraron nucleasas dirigidas como una forma alternativa de abordar el aumento de la eficiencia de la modificación genética intervenida por HDR. Cuando se ha creado una DSB dirigida, la HDR puede recrear el ADN cortado utilizando un diseño de ADN exógeno cercano a la agrupación del sitio de ruptura. Este componente se puede utilizar para presentar cambios precisos al entregar un diseño de reparación bien estructurado a las células dirigidas directamente,9,10 por lo tanto, de una manera específica del sitio, lo que provoca la modificación de la transformación o la inclusión de una nueva sucesión. Por otro lado, la reparación intervenida por NHEJ tiende a resultar en errores, ya que induce una disposición competente de inclusión o eliminación de calidad (indels) en diferentes longitudes en el sitio DSB, lo que a la larga causa una inactivación de calidad.11 Si las indels ocurren en el grupo codificante, habrá transformaciones de cambio de marco, que provocarán la corrupción del ARNm o la creación de proteínas acortadas no funcionales por descomposición intermediada por balbuceo.12 Se cree que esta metodología y sus aplicaciones son más sencillas que las técnicas basadas en HR debido a que (a) no hay necesidad de una red fija y (b) el tipo de telómero tiene menos efecto sobre la eficacia de la mutación (a pesar de HR, NHEJ puede ser dinámico durante todo el ciclo del telómero).13 Por lo tanto, al igual que el ARNi, NHEJ se puede aplicar en líneas celulares deificadas para producir la inactivación de un solo gen o de varios genes, pero al realizar modificaciones con pérdida de trabajo, puede provocar una inactivación duradera del gen.9 En la fase de desarrollo inicial de la alteración del genoma, para iniciar los DSB adecuados en cada sitio diana de ADN específico, la construcción de nucleasas de dedo de zinc (ZFN)14 o meganucleasas15 distintivas ha sido el centro de investigación. Estos sistemas de nucleasas requerían una habilidad especial para crear proteínas falsas que comprendían espacios de restricción de ADN específicos de disposición ajustable, cada uno asociado con una nucleasa difusa para la escisión del objetivo, lo que proporcionó a los científicos herramientas fenomenales para realizar la manipulación genética.16 Posteriormente, otra clase de un área reactiva de Flavobacterium okeanokoites (FokI) derivada de proteínas bacterianas denominadas efectores similares a activadores de traducción (TALE) ha revelado información sobre oportunidades adicionales para la edición precisa del genoma.17 Las nucleasas programables basadas en TALE pueden cortar cualquier agrupación de ADN de interés con una recurrencia moderadamente alta. No obstante, las principales dificultades para los métodos de nucleasas efectoras similares a activadores de traducción (TALEN) son el plan de una clonación atómica compleja para cada nuevo objetivo de ADN y su baja productividad de cribado genómico en células bien dirigidas. Biografía Guido Krupp es el director ejecutivo y presidente de Amptec GmbH. Recibió su doctorado de la Universidad de Würzburg y el Instituto Max-Planck, Martinsried. Realizó su posdoctorado en la Universidad de Yale. Actualmente es líder de un grupo de investigación en la Universidad de Kiel. Es el fundador de Artus GmbH y Amptec GmbH. Sus intereses de investigación incluyen la tecnología de ácidos nucleicos con especial atención al ARN, los patógenos vegetales (viroides), las ribozimas y la telomerasa. Ha publicado más de 60 artículos y ha sido designado editor de Ribozyme Biochemistry & Biotechnology y de Telomeres, Telomerases & Cancer, y miembro del consejo editorial de Biotechnology Annual Review. krupp@amp-tec.com9 En la fase inicial de desarrollo de la alteración del genoma, para iniciar los DSB ideales en cada sitio objetivo de ADN específico, la construcción de nucleasas de dedos de zinc (ZFN)14 o meganucleasas15 distintivas ha sido el centro de investigación. Estas estructuras de nucleasas requerían una habilidad especial para crear proteínas artificiales que comprendían espacios de restricción de ADN específicos de disposición variable, cada uno asociado con una nucleasa vaga para la escisión del objetivo, lo que proporcionaba a los científicos herramientas fenomenales para realizar la manipulación genética.16 Posteriormente, otra clase de un área reactiva de Flavobacterium okeanokoites (FokI) derivada de proteínas bacterianas denominadas efectores similares a activadores de interpretación (TALE) ha revelado información sobre oportunidades adicionales para la edición precisa del genoma.17 Las nucleasas programables basadas en TALE pueden cortar cualquier agrupación de ADN de interés con una recurrencia relativamente alta. No obstante, las dificultades fundamentales de los enfoques de las nucleasas efectoras de tipo activador de la traducción (TALEN) son el plan de una clonación atómica compleja para cada nuevo objetivo de ADN y su baja productividad de cribado genómico en células efectivamente enfocadas. Biografía Guido Krupp es el CEO y presidente de Amptec GmbH. Recibió su doctorado de la Universidad de Würzburg y el Instituto Max-Planck, Martinsried. Hizo su posdoctorado en la Universidad de Yale. Es designado como líder del grupo de investigación en la Universidad de Kiel. Es el fundador de Artus GmbH y Amptec GmbH. Sus intereses de investigación incluyen la tecnología de ácidos nucleicos con foco en ARN, patógenos vegetales (viroides), ribozimas y telomerasa. Ha publicado más de 60 publicaciones y ha sido designado como editor de Ribozyme Biochemistry & Biotechnology y de Telomeres, Telomerases & Cancer, y miembro del consejo editorial de Biotechnology Annual Review. krupp@amp-tec.com9 En la fase inicial de desarrollo de la alteración del genoma, para iniciar los DSB ideales en cada sitio objetivo de ADN específico, la construcción de nucleasas de dedos de zinc (ZFN)14 o meganucleasas15 distintivas ha sido el centro de investigación. Estas estructuras de nucleasas requerían una habilidad especial para crear proteínas artificiales que comprendían espacios de restricción de ADN específicos de disposición variable, cada uno asociado con una nucleasa vaga para la escisión del objetivo, lo que proporcionaba a los científicos herramientas fenomenales para realizar la manipulación genética.16 Posteriormente, otra clase de un área reactiva de Flavobacterium okeanokoites (FokI) derivada de proteínas bacterianas denominadas efectores similares a activadores de interpretación (TALE) ha revelado información sobre oportunidades adicionales para la edición precisa del genoma.17 Las nucleasas programables basadas en TALE pueden cortar cualquier agrupación de ADN de interés con una recurrencia relativamente alta. No obstante, las dificultades fundamentales de los enfoques de las nucleasas efectoras de tipo activador de la traducción (TALEN) son el plan de una clonación atómica compleja para cada nuevo objetivo de ADN y su baja productividad de cribado genómico en células efectivamente enfocadas. Biografía Guido Krupp es el CEO y presidente de Amptec GmbH. Recibió su doctorado de la Universidad de Würzburg y el Instituto Max-Planck, Martinsried. Hizo su posdoctorado en la Universidad de Yale. Es designado como líder del grupo de investigación en la Universidad de Kiel. Es el fundador de Artus GmbH y Amptec GmbH. Sus intereses de investigación incluyen la tecnología de ácidos nucleicos con foco en ARN, patógenos vegetales (viroides), ribozimas y telomerasa. Ha publicado más de 60 publicaciones y ha sido designado como editor de Ribozyme Biochemistry & Biotechnology y de Telomeres, Telomerases & Cancer, y miembro del consejo editorial de Biotechnology Annual Review. krupp@amp-tec.comLas dificultades fundamentales de los enfoques de las nucleasas efectoras de tipo activador de la traducción (TALEN) son el plan de una clonación atómica compleja para cada nuevo objetivo de ADN y su baja productividad de cribado genómico en células efectivamente enfocadas. Biografía Guido Krupp es el CEO y presidente de Amptec GmbH. Recibió su doctorado de la Universidad de Würzburg y el Instituto Max-Planck, Martinsried. Hizo su posdoctorado en la Universidad de Yale. Es designado como líder del grupo de investigación en la Universidad de Kiel. Es el fundador de Artus GmbH y Amptec GmbH. Sus intereses de investigación incluyen la tecnología de ácidos nucleicos con foco en ARN, patógenos vegetales (viroides), ribozimas y telomerasa. Ha publicado más de 60 publicaciones y ha sido designado como editor de Ribozyme Biochemistry & Biotechnology y de Telomeres, Telomerases & Cancer, y miembro del consejo editorial de Biotechnology Annual Review. krupp@amp-tec.comLas dificultades fundamentales de los enfoques de las nucleasas efectoras de tipo activador de la traducción (TALEN) son el plan de una clonación atómica compleja para cada nuevo objetivo de ADN y su baja productividad de cribado genómico en células efectivamente enfocadas. Biografía Guido Krupp es el CEO y presidente de Amptec GmbH. Recibió su doctorado de la Universidad de Würzburg y el Instituto Max-Planck, Martinsried. Hizo su posdoctorado en la Universidad de Yale. Es designado como líder del grupo de investigación en la Universidad de Kiel. Es el fundador de Artus GmbH y Amptec GmbH. Sus intereses de investigación incluyen la tecnología de ácidos nucleicos con foco en ARN, patógenos vegetales (viroides), ribozimas y telomerasa. Ha publicado más de 60 publicaciones y ha sido designado como editor de Ribozyme Biochemistry & Biotechnology y de Telomeres, Telomerases & Cancer, y miembro del consejo editorial de Biotechnology Annual Review. krupp@amp-tec.com
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